컨포컬 현미경

컨포컬 현미경 이란?

컨포컬 현미경(confocal microscope)기술은 가장 진보된 방식의 광학 현미경 기술입니다. 컨포컬 현미경은 일반 광학 현미경의 특성을 유지하면서도 높은 해상도로 3 차원 형상을 측정할 수 있기 때문에, 다양한 마이크로미터 스케일의 3 차원 측정이 필요한 대부분의 분야에서 활용할 수 있습니다. 컨포컬 현미경의 원리는 1950년대 중반에 최초로 고안이 되었으나, 충분한 컨포컬 현미경의 성능 구현을 위해서는 레이저와 디지털 이미징 소프트웨어를 필요로 하였기 때문에 당시에는 그 가능성의 일부만을 구현할 수 있었습니다.
현대의 컨포컬 현미경과 기계적으로 유사한 형태는 관련된 컴퓨터 기술과 레이저 기술이 가능했던 1970년 후반에 이르러 구현될 수 있었으며, 1980년대에 이르러서는 생물학 분야를 중점으로 본격적인 보급이 되었는데, 특히 컨포컬 현미경의 형광 영상화 기술은 많은 생물학 연구자들에게 한 단계 높은 시야를 제공해주어 생물 분야의 발전을 촉진시키는데 지대한 역할을 하였습니다.

컨포컬 현미경의 원리도를 살펴보면 광원으로부터의 빛이 광분할기(beam splitter)에 의해 대물렌즈 쪽으로 방향을 전환하고 대물렌즈를 통과한 빛은 시편을 조사하게 됩니다. 시편에서 다시 발현 또는 반사되는 빛이 되돌아갈 때에는 광분할기를 통과하여 광검출기(photo-detector) 쪽으로 진행하게 되며, 이때 광원부와 시편부, 핀홀부의 각 점들은 서로 공액관계(conjugate)를 형성합니다. 컨포컬 현미경의 가장 독특한 부품은 핀홀(pinhole)이라고 할 수 있습니다. 핀홀은 단어 그대로 ‘바늘구멍’으로 대물렌즈의 초점에서의 빛만 광검출기로 보내주는 역할을 합니다. 즉, 핀홀은 매우 작은 구멍으로 이상적으로는 점으로 생각할 수 있는데 이 점을 통과할 수 있는 대물렌즈의 초점은 역시 공간상의 한 점으로 결정됩니다. 이것이 의미하는 바는 이 점 이외에서 발현되는 빛들은 핀홀 조리개에 의해 모두 차단된다는 것입니다.

그림에서 실선으로 나타낸 광선은 핀홀을 통과하는 초점 위치의 광선을 나타내고 있습니다. 그림에서 나타낸 바와 같이 실선에 의해 형성되는 초점에서의 빛은 모두 핀홀을 통과하여 광검출기에 도달하게 됩니다. 반면 점선은 앞에서 언급한 실선의 초점으로부터 광축 방향으로 벗어난 위치인데, 시편부의 초점 위치가 달라짐에 따라 검출부의 초점위치도 함께 달라지면서 핀홀이 위치한 평면상에서는 한 점이 아닌 넓게 퍼진 원형 영역으로 영상이 맺히게 되고, 결국 매우 작은 광량만이 (이상적으로는 모두 차단되어) 핀홀을 통과하여 광검출기에 도달하게 됩니다. 즉, 그림과 같은 구조의 광학계는 공간상의 한 점에서만의 신호를 검출하게 되는데, 이것이 바로 컨포컬 현미경의 고유한 특성인 광학적인 절편 (optical sectioning)을 가능하게 합니다.

컨포컬 현미경이 다른 광학측정기와 구별되는 또 다른 특징은 반투명(semi-transparent) 재질일 경우 투과 영상화가 가능하다는 것입니다. 이것은 주로 세포조직과 같은 반투명 시편의 경우 내부 구조의 관찰까지 가능한 진정한 3차원 구성을 가능하게 합니다.
다른 비접촉식 광학적 3차원 측정기술은 측정 영상을 재해석하여 3차원으로 구현하는 것에 비해 컨포컬 현미경의 측정 원리는 상당히 직접적입니다. 컨포컬 현미경 역시 비접촉식 광학 측정 방법이지만, 개념적으로는 오히려 스타일러스 타입에 더 가깝다고 할 수 있습니다. 공간상의 한 점을 얼마나 작게 구현하는가에 의해 분해능이 결정되는 것도 탐침의 크기에 의해 분해능이 결정되는 스타일러스 프로파일러와 비슷하다고 할 수 있겠다. 실제로 광학 한계를 넘는 고분해능의 컨포컬 현미경을 개발하기 위해 공간상의 한 점을 작게 만들기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 이러한 스타일러스 타입의 측정은 별도의 영상 재해석 과정을 필요로 하지 않기 때문에 진동과 같은 현장 환경에 대해 강인하다는 장점을 갖게 됩니다.

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